Nowatorska metoda oznaczania lisinoprilu z wykorzystaniem nanocząstek węglowych

Jakie znaczenie ma lisinopril w medycynie sercowo-naczyniowej?

Inhibitory konwertazy angiotensyny (ACE) stanowią jedną z najczęściej przepisywanych klas leków w medycynie układu sercowo-naczyniowego, będąc podstawowym elementem leczenia nadciśnienia tętniczego, niewydolności serca, przewlekłej choroby nerek oraz w postępowaniu po zawale mięśnia sercowego. Wśród rodziny inhibitorów ACE, lisinopril wyłonił się jako szczególnie istotny lek, przepisywany od prawie trzech dekad w leczeniu nadciśnienia tętniczego oraz w celu zmniejszenia obciążenia układu sercowo-naczyniowego poprzez kompetycyjne hamowanie enzymu konwertującego angiotensynę. Znaczenie kliniczne lisinoprilu wykracza poza kontrolę ciśnienia tętniczego, ponieważ wykazuje on udowodnioną skuteczność w zapobieganiu poważnym zdarzeniom sercowo-naczyniowym, w tym ostremu zawałowi mięśnia sercowego, udarowi mózgu i hospitalizacjom z powodu niewydolności serca, jednocześnie zapewniając efekt nefroprotekcyjny w nefropatii cukrzycowej. Jako nieprodrug inhibitor ACE z przeważającą eliminacją nerkową i korzystnymi właściwościami farmakokinetycznymi, lisinopril pozostaje jednym z najczęściej przepisywanych inhibitorów ACE na świecie.

Rozległe zastosowanie kliniczne lisinoprilu wymaga solidnego monitorowania terapeutycznego i rygorystycznych protokołów kontroli jakości, aby zapewnić optymalne wyniki leczenia, szczególnie biorąc pod uwagę kluczowe znaczenie optymalizacji dawki i możliwość wystąpienia poważnych działań niepożądanych, w tym hiperkaliemii, ostrego uszkodzenia nerek i obrzęku naczynioruchowego. Ponadto, zaangażowanie przemysłu farmaceutycznego w zapewnienie jakości wymaga zaawansowanych metodologii analitycznych do ilościowego oznaczania lisinoprilu zarówno w substancjach leczniczych, jak i w preparatach farmaceutycznych, wspierając zgodność z wytycznymi Międzynarodowej Rady Harmonizacji (ICH) i zapewniając spójną skuteczność terapeutyczną w różnych populacjach pacjentów.

Czy nowatorskie nanocząstki zmieniają podejście analityczne?

Dotychczasowe metody analityczne oznaczania lisinoprilu obejmują różne techniki, jednak każda z nich ma swoje ograniczenia, które mogą utrudniać rutynowe stosowanie. Metody HPLC są szeroko stosowane w analizie farmaceutycznej lisinoprilu, jednak często wymagają długotrwałej elucji gradientowej i złożonej optymalizacji fazy ruchomej, co zmniejsza przepustowość analityczną. Podejścia LC-MS/MS oferują doskonałą czułość dla zastosowań bioanalitycznych, ale wymagają kosztownej aparatury, złożonej ekstrakcji do fazy stałej i specjalistycznej wiedzy technicznej, co ogranicza dostępność laboratoryjną. Metody elektrochemiczne zapewniają ekonomiczne alternatywy, ale napotykają wyzwania związane z selektywnością i wymagają specjalistycznych materiałów elektrodowych. Metody spektrofluorymetryczne zyskały uwagę ze względu na ich czułość, ale wymagają drogich odczynników do derywatyzacji, podwyższonej temperatury (60°C) i wydłużonego czasu reakcji (70 minut), co zmniejsza przepustowość analityczną. Te ograniczenia ograniczają ich rutynowe zastosowanie i podkreślają potrzebę prostszych, bardziej ekonomicznych podejść opartych na fluorescencji.

Kropkowe nanocząstki węglowe (CQDs) pojawiły się jako obiecujące nanomateriały fluorescencyjne do zastosowań w chemii analitycznej, reprezentując zmianę paradygmatu od tradycyjnych półprzewodnikowych kropek kwantowych w kierunku bardziej zrównoważonych i biokompatybilnych alternatyw. Od momentu ich odkrycia podczas oczyszczania nanorurek węglowych w 2004 roku, CQDs wykazały niezwykły potencjał analityczny ze względu na ich unikalne właściwości optyczne zależne od rozmiaru, doskonałą rozpuszczalność w wodzie, niską toksyczność i ekonomiczną syntezę z odnawialnych prekursorów. Wprowadzenie heteroatomów, szczególnie współdomieszkowanie borem i azotem, znacznie poprawiło optyczne i analityczne właściwości CQDs poprzez synergistyczne modyfikacje struktury elektronowej, które tworzą nowe poziomy energetyczne i zmniejszają lukę HOMO-LUMO. B,N-domieszkowane CQDs wykazują doskonałe wydajności kwantowe w zakresie 15-59%, reprezentując do 12-krotną poprawę w porównaniu z niedomieszkowymi systemami, przy jednoczesnym zachowaniu doskonałej fotostabilności i tolerancji pH w zakresie fizjologicznym.

Te ulepszone właściwości umożliwiły niezwykłe osiągnięcia w analizie farmaceutycznej, a ostatnie badania wykazały nanomolarne granice wykrywalności dla różnych cząsteczek leków, w tym tetracykliny (1 nM), dopaminy (11 nM) i związków fenolowych (0,024-0,05 μM) poprzez różne mechanizmy wygaszania fluorescencji. Te mechanizmy obejmują głównie wygaszanie statyczne, fotoindukowalne przenoszenie elektronów i efekty wewnętrznego filtra, zapewniając wysoką selektywność i czułość dla związków farmaceutycznych zawierających grupy aminowe i układy aromatyczne. Pomimo tych postępów, zastosowanie B,N-domieszkowanych CQDs do oznaczania inhibitorów ACE pozostaje w dużej mierze niezbadane, szczególnie w przypadku lisinoprilu, który stanowi wyjątkowe wyzwania analityczne ze względu na brak silnych chromoforów i złożoność matryc biologicznych.

Jak stworzono i scharakteryzowano B,N CQDs do oznaczania lisinoprilu?

Niniejsze badanie miało na celu opracowanie i walidację nowej, czułej i przyjaznej dla środowiska metody wygaszania fluorescencji “turn-off” do oznaczania lisinoprilu przy użyciu kropkowych nanocząstek węglowych współdomieszkowanych borem i azotem (B,N CQDs) jako sond fluorescencyjnych. Szczegółowe cele badawcze obejmowały: (1) syntezę i kompleksową charakterystykę B,N CQDs poprzez techniki fizykochemiczne i optyczne, w tym rozkład wielkości, morfologię powierzchni i analizę strukturalną; (2) zbadanie mechanizmu wygaszania fluorescencji między B,N CQDs a lisinoprilem przy użyciu kinetyki Sterna-Volmera, badań termodynamicznych i obliczeń mechaniki kwantowej w celu zrozumienia interakcji na poziomie molekularnym; (3) systematyczną optymalizację warunków eksperymentalnych (pH, stężenie B,N CQDs i czas reakcji) poprzez metodologię powierzchni odpowiedzi Box-Behnken; (4) walidację opracowanej metody zgodnie z wytycznymi ICH, oceniając liniowość, precyzję, dokładność, odporność, selektywność i granice wykrywalności; (5) wykazanie praktycznej aplikacyjności poprzez analizę rzeczywistych preparatów farmaceutycznych i próbek biologicznych; oraz (6) przeprowadzenie kompleksowej oceny środowiskowej przy użyciu różnych wskaźników zielonej chemii analitycznej w celu ustalenia profilu zrównoważonego rozwoju metody.

B,N CQDs zostały zsyntezowane przy użyciu metody rozkładu termicznego. Kwas cytrynowy (0,5 g) i kwas borowy (0,1 g) zostały całkowicie rozpuszczone w 50 ml wody dejonizowanej przy mieszaniu magnetycznym. Następnie dodano mocznik (0,2 g) jako źródło azotu, a mieszaninę energicznie mieszano przez 30 minut w celu zapewnienia całkowitego rozpuszczenia i homogenizacji. Roztwór prekursora przeniesiono do autoklawu ze stali nierdzewnej wyłożonego teflonem i umieszczono w piecu muflowym podgrzanym do 200°C. Obróbkę termiczną utrzymywano przez 3 godziny w warunkach atmosfery otoczenia, aby ułatwić procesy karbonizacji i domieszkowania heteroatomami. Podczas ogrzewania początkowo bezbarwny roztwór stopniowo przekształcał się w żółty, następnie pomarańczowy i w końcu w ciemnobrązowy, wskazując na pomyślne tworzenie się struktury węglowej i wbudowywanie heteroatomów. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej produkt rozpuszczono w 20 ml wody dejonizowanej i sonikowano przez 15 minut, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie. Otrzymany brązowy roztwór przefiltrowano przez filtr membranowy 0,22 μm w celu usunięcia nierozpuszczonych cząstek lub dużych agregatów. Oczyszczanie osiągnięto poprzez dializę przy użyciu membrany celulozowej (punkt odcięcia masy cząsteczkowej 1000 Da) z wodą dejonizowaną przez 48 godzin, zmieniając wodę co 8 godzin, aby usunąć nieprzereagowane prekursory i zanieczyszczenia o niskiej masie cząsteczkowej. Oczyszczony roztwór odparowano do sucha, otrzymując końcowy oczyszczony produkt B,N CQDs z wydajnością 134,2 mg (16,78% w oparciu o 800 mg całkowitych materiałów wyjściowych).

Kompleksowa charakterystyka fizykochemiczna potwierdziła udaną syntezę wysokiej jakości B,N CQDs o pożądanych właściwościach analitycznych. Analiza DLS wykazała, że syntezowane B,N CQDs miały jednorodny rozkład wielkości ze średnią średnicą cząstek 3,97 nm i odchyleniem standardowym 1,48 nm. Analiza TEM potwierdziła monodyspersyjny charakter nanocząstek, ujawniając sferyczną morfologię z dobrze zdefiniowanymi granicami i jednolitym rozkładem kontrastu. Ten wąski rozkład wielkości jest szczególnie istotny dla spójnych właściwości optycznych i powtarzalności analitycznej. Charakterystyka strukturalna za pomocą spektroskopii FTIR ujawniła charakterystyczne grupy funkcyjne, które sugerowały udaną funkcjonalizację powierzchni i wprowadzenie heteroatomów podczas procesu syntezy termicznej. W szczególności, szerokie pasmo absorpcji przy 3200-3600 cm^-1 przypisano drganiom rozciągającym O-H i N-H, potwierdzając obecność grup hydroksylowych i aminowych na powierzchni CQDs, zgodnie z oczekiwaniami dla prekursorów kwasu cytrynowego i mocznika. Pik przy około 1650 cm^-1 odpowiada drganiom rozciągającym C=O, które mogą pochodzić z wielu funkcjonalności zawierających grupę karbonylową, w tym kwasów karboksylowych, ketonów, laktonów lub grup amidowych tworzących się podczas procesu syntezy hydrotermalnej. Charakterystyczny pik obserwowany przy 1380 cm^-1 został konsekwentnie przypisany drganiom rozciągającym B-N w materiałach węglowych współdomieszkowanych borem i azotem zgodnie z ustaloną literaturą. Te grupy funkcyjne powierzchni są niezbędne do zwiększenia rozpuszczalności w wodzie i ułatwienia interakcji molekularnych z docelowymi analitami.

Badania charakterystyki optycznej wykazały, że B,N CQDs posiadały doskonałe właściwości fotofizyczne wynikające z efektów domieszkowania heteroatomami. Początkowo widmo absorpcji UV-widzialne wykazało silną absorpcję poniżej 250 nm o wysokiej intensywności (absorbancja ~3,0) przypisaną przejściom π-π* szkieletu węglowego aromatycznego, wraz z wtórnym pasmem absorpcji skupionym wokół 330 nm o umiarkowanej intensywności (absorbancja ~0,8) odpowiadającym przejściom n-π* obejmującym pary elektronowe azotu i stany defektowe wprowadzone przez domieszkowanie heteroatomami. Następnie właściwości fluorescencyjne zostały ocenione za pomocą spektroskopii wzbudzenia-emisji, która wykazała, że przy wzbudzeniu przy 360 nm, B,N CQDs wykazywały intensywną niebieską fluorescencję z maksimum emisji przy 429 nm, co skutkowało dużym przesunięciem Stokesa wynoszącym 69 nm, które skutecznie minimalizuje interferencje od rozproszonego światła wzbudzającego. Przesunięcie 30 nm od maksimum absorpcji (330 nm) do optymalnej długości fali wzbudzenia (360 nm) jest charakterystyczne dla kropek kwantowych węglowych domieszkowanych heteroatomami, wynikające z przejść stanów pułapkowych n-π obejmujących elektrony par elektronowych na dopantach boru i azotu oraz stanach emisyjnych defektów powierzchniowych, które są optymalnie obsadzone przy dłuższych długościach fal wzbudzenia. Wydajność kwantowa została obliczona na 64,2% przy użyciu siarczanu chininy jako odniesienia, co stanowi znaczną poprawę w porównaniu z niedomieszkowymi CQDs dzięki synergistycznym efektom elektronowym współdomieszkowania borem i azotem. Te solidne właściwości optyczne, w połączeniu z doskonałą fotostabilnością, sprawiają, że syntezowane B,N CQDs są szczególnie odpowiednie do zastosowań analitycznych wymagających spójnej odpowiedzi fluorescencyjnej.

Jakie mechanizmy odpowiedzialne są za wygaszanie fluorescencji?

Oddziaływanie między B,N CQDs a lisinoprilem zostało systematycznie zbadane w celu wyjaśnienia podstawowego mechanizmu wygaszania i ustanowienia teoretycznych podstaw opracowanej metody analitycznej. Widma emisji fluorescencji wykazały progresywny spadek intensywności fluorescencji wraz ze wzrostem stężenia lisinoprilu od 0 do 2 μg mL^-1, wskazując na skuteczne wygaszanie fluorescencji B,N CQDs przez analizowany analit. To zachowanie zależne od stężenia posłużyło jako podstawa do ilościowego oznaczenia lisinoprilu i uzasadniało kompleksowe badania mechanistyczne w celu optymalizacji wydajności analitycznej.

Początkowo możliwość efektu wewnętrznego filtra została oceniona poprzez analizę absorpcji UV-widzialnej lisinoprilu. Widmo absorpcji lisinoprilu wykazało zaniedbywalną absorpcję powyżej 250 nm, praktycznie bez mierzalnej absorbancji w regionach długości fali wzbudzenia i emisji B,N CQDs. Ten brak nakładania się widm skutecznie wykluczył efekt wewnętrznego filtra jako główny mechanizm wygaszania, potwierdzając tym samym, że obserwowane wygaszanie fluorescencji wynikało z rzeczywistych interakcji molekularnych między fluoroforem a analitem.

Następnie przeprowadzono analizę Sterna-Volmera w celu ilościowego określenia wydajności wygaszania i określenia charakteru mechanizmu oddziaływania. Liniowe wykresy Sterna-Volmera w trzech różnych temperaturach (298, 303 i 313 K) dały stałe Sterna-Volmera (K_sv) wynoszące odpowiednio 7,94 × 10⁵, 7,11 × 10⁵ i 5,48 × 10⁵ M^-1. Warto zauważyć, że wartości K_sv wykazały systematyczny spadek wraz ze wzrostem temperatury, co jest charakterystyczne dla mechanizmów wygaszania statycznego raczej niż dynamicznego wygaszania kolizyjnego. Aby dalej potwierdzić ten wniosek, stałe szybkości wygaszania bimolekularnego (K_q) zostały obliczone przy użyciu zależności: K_q = K_sv/τ₀, gdzie τ₀ reprezentuje czas życia fluorescencji B,N CQDs w nieobecności wygaszacza. Biorąc pod uwagę typowy czas życia fluorescencji kropek kwantowych węglowych w zakresie nanosekundowym (5-10 ns), obliczone wartości K_q wahały się od 10¹³ do 10¹⁴ M^-1s^-1, co znacznie przekracza limit kontrolowany dyfuzją (10¹⁰ M^-1s^-1) dla dynamicznego wygaszania w roztworach wodnych. Te ustalenia dostarczają przekonujących dowodów na mechanizm wygaszania statycznego obejmujący tworzenie kompleksu w stanie podstawowym między B,N CQDs a lisinoprilem.

Ponadto, stałe wiązania (K_a) zostały wyznaczone przy użyciu zmodyfikowanego równania Sterna-Volmera dla wygaszania statycznego: F₀/F₀ – F = 1/K_a[Q] + 1/K_a, gdzie F₀ i F reprezentują intensywności fluorescencji w nieobecności i obecności wygaszacza. Obliczone wartości K_a wynosiły odpowiednio 1,36 × 10⁶, 1,10 × 10⁶ i 0,82 × 10⁶ M^-1 przy 298, 303 i 313 K. Znaczna wielkość tych stałych wiązania wskazuje na silne powinowactwo między B,N CQDs a lisinoprilem, podczas gdy ich spadek zależny od temperatury dodatkowo potwierdza mechanizm wygaszania statycznego.

Parametry termodynamiczne dostarczyły dodatkowych informacji na temat natury oddziaływania wiążącego. Ujemne wartości energii swobodnej Gibbsa (ΔG = -35,01, -35,06 i -35,46 kJ mol^-1 przy 298, 303 i 313 K) potwierdziły spontaniczny charakter procesu wiązania. Ujemna zmiana entalpii (ΔH = -26,00 kJ mol^-1) sugerowała, że interakcja była egzotermiczna i głównie napędzana przez siły van der Waalsa i wiązania wodorowe. Dodatkowo, dodatnia zmiana entropii (ΔS = 30,21 J mol^-1 K^-1) wskazywała na zwiększoną przypadkowość przy tworzeniu kompleksu, prawdopodobnie z powodu uwolnienia związanych cząsteczek wody z miejsc interakcji. Te sygnatury termodynamiczne są zgodne z mechanizmem wygaszania statycznego obejmującym wiązania wodorowe i interakcje elektrostatyczne między grupami aminowymi i karboksylowymi lisinoprilu a grupami funkcyjnymi powierzchni B,N CQDs, jak potwierdzają wyniki charakterystyki FTIR.

Czy obliczenia teoretyczne potwierdzają eksperymentalne wyniki?

Obliczenia teoretyczne przeprowadzono w celu zapewnienia wglądu na poziomie molekularnym w mechanizm oddziaływania między B,N-CQDs a lisinoprilem, w oparciu o model obliczeniowy zgodny z eksperymentalnymi dowodami FTIR. Wybrano półempiryczną metodę PM6 ze względu na jej ulepszoną parametryzację dla systemów zawierających heteroatomy, szczególnie bor i azot, w porównaniu z wcześniejszymi metodami półempirycznymi. Ponadto, stosunkowo duży rozmiar modelu fragmentu B,N-CQDs wymagał obliczeniowo wydajnego podejścia, które mogłoby zapewnić rozsądną dokładność dla obliczeń energii wiązania, pozostając jednocześnie obliczeniowo wykonalnym dla przeprowadzonych systematycznych badań. Do celów modelowania teoretycznego skonstruowano reprezentatywny fragment struktury B,N-CQDs w oparciu o kompleksowe dowody charakterystyki eksperymentalnej. Wybór struktury modelu był kierowany danymi spektroskopii FTIR pokazującymi charakterystyczne drgania rozciągające B-N przy 1380 cm^-1, analizą elementarną CHN potwierdzającą włączenie azotu (11,84%) oraz metodologią syntezy wykorzystującą kwas borowy i mocznik jako źródła heteroatomów. Model fragmentu zawierał rdzeń aromatycznego systemu węglowego z atomami boru bezpośrednio związanymi z atomami azotu, zgodnie z przypisaniem drgań rozciągających B-N wspieranym literaturą. Reprezentatywne grupy funkcyjne powierzchni, takie jak grupy karboksylowe (-COOH) i hydroksylowe (-OH), zostały włączone w oparciu o dowody FTIR, odzwierciedlając eksperymentalne warunki syntezy i wyniki charakterystyki.

Optymalizacja geometrii przy użyciu półempirycznej metody PM6 dała stabilne struktury zarówno dla poszczególnych składników, jak i ich kompleksu. Zoptymalizowana struktura lisinoprilu wykazała całkowitą energię -0,350620 hartree, podczas gdy fragment B,N CQDs wykazał nieco niższą energię -0,434781 hartree, wskazując na wrodzoną stabilność obu systemów molekularnych. Następnie zoptymalizowane tworzenie kompleksu dało całkowitą energię -0,798190 hartree, reprezentując energetycznie korzystną konfigurację wiązania między fluoroforem a analitem.

Energia wiązania (ΔE) została obliczona przy użyciu podejścia supermolekularnego, dając wartość -0,012789 hartree, co przekłada się na -33,58 kJ mol^-1 dla tworzenia kompleksu. Ta ujemna energia wiązania potwierdziła termodynamicznie korzystne oddziaływanie między B,N CQDs a lisinoprilem, które doskonale koreluje z eksperymentalnie wyznaczonymi wartościami energii swobodnej Gibbsa (ΔG = -35,01 do -35,46 kJ mol^-1) uzyskanymi z analizy termodynamicznej, z odchyleniem mniejszym niż 5%. Doskonała zgodność między wartościami teoretycznymi a eksperymentalnymi potwierdza model obliczeniowy i pokazuje, że metoda PM6 odpowiednio ujmuje istotne oddziaływania wiążące, pomimo uproszczonego systemu modelowego i obliczeń w fazie gazowej.

Jak zoptymalizowano warunki eksperymentalne metodą Box-Behnken?

Systematyczna optymalizacja warunków eksperymentalnych została przeprowadzona przy użyciu metodologii powierzchni odpowiedzi Box-Behnken w celu maksymalizacji wydajności wygaszania fluorescencji i ustanowienia solidnych wyników analitycznych. Projekt Box-Behnken to metodologia powierzchni odpowiedzi, która wykorzystuje podejście czynnikowe trzystopniowe, aby skutecznie zbadać zależność między wieloma zmiennymi niezależnymi a odpowiedzią poprzez strategicznie rozmieszczone punkty eksperymentalne. Ten projekt oferuje znaczące korzyści w porównaniu z tradycyjnymi podejściami jednowymiarowymi, wymagając mniej eksperymentów przy jednoczesnym zachowaniu ważności statystycznej dla szacowania kwadratowych powierzchni odpowiedzi i interakcji czynników. Matryca projektu eksperymentalnego obejmowała trzy krytyczne czynniki: pH roztworu (A: 3,0-9,0), stężenie B,N CQDs (B: 30-90 μg mL^-1) i czas reakcji (C: 3,0-10,0 minut), przy czym wydajność wygaszania (QE%) służyła jako zmienna odpowiedzi. Analiza wariancji (ANOVA) wykazała istotność statystyczną opracowanego modelu z wartością F wynoszącą 49,69 i wartością p < 0,0001, potwierdzając, że model odpowiednio opisuje dane eksperymentalne i może być użyty do celów optymalizacji. Brak dopasowania nie był istotny (p = 0,1901), wskazując, że model dobrze pasuje do danych eksperymentalnych bez błędu systematycznego, podczas gdy składnik czystego błędu potwierdza powtarzalność pomiarów eksperymentalnych.

Matematyczna zależność między zmienną odpowiedzi a niezależnymi czynnikami została wyrażona poprzez następujące zakodowane równanie wyprowadzone z analizy regresji wielokrotnej: QE% = 2,96213 + 0,231511 × A + 0,414689 × B + 0,19792 × AB – 0,686 × A² – 0,589935 × B², gdzie A i B reprezentują zakodowane wartości pH i stężenia B,N CQDs. Dodatnie współczynniki liniowe dla pH (0,231511) i stężenia B,N CQDs (0,414689) wskazują, że zwiększenie tych czynników zwiększa wydajność wygaszania w badanych zakresach. Warto zauważyć, że stężenie B,N CQDs wykazuje największy współczynnik liniowy, sugerując jego dominujący wpływ na wydajność analityczną. Dodatni współczynnik interakcji (AB = 0,19792) ujawnia synergistyczne efekty między pH a stężeniem B,N CQDs, wskazując, że optymalna odpowiedź wymaga jednoczesnej optymalizacji obu czynników. Z drugiej strony, ujemne współczynniki kwadratowe dla pH (A² = -0,686) i stężenia B,N CQDs (B² = -0,589935) potwierdzają istnienie punktów optymalnych, a nie liniowych zależności, wspierając krzywiznę obserwowaną na wykresach powierzchni odpowiedzi.

Adekwatność modelu została rygorystycznie oceniona poprzez kompleksową analizę statystyczną. Współczynnik determinacji (R² = 0,9576) wskazał, że 95,76% zmienności w wydajności wygaszania może być wyjaśnione przez model, podczas gdy skorygowany R² (0,9383) uwzględnia liczbę terminów w modelu i potwierdza doskonałą jakość dopasowania. Przewidywany R² (0,8429) wykazuje zadowalającą zdolność predykcyjną, przy czym różnica między skorygowanym a przewidywanym R² jest mniejsza niż 0,2, wskazując na dobrą stabilność modelu. Ponadto, wartość adekwatnej precyzji wynosząca 19,2989 znacznie przekracza minimalny próg 4,0, potwierdzając, że model ma wystarczający stosunek sygnału do szumu dla wiarygodnej optymalizacji. Współczynnik zmienności (6,37%) mieści się w akceptowalnych granicach, wskazując na dobrą powtarzalność pomiarów eksperymentalnych.

Wykresy efektów głównych dostarczyły kompleksowego wglądu w indywidualny wpływ czynników na wydajność wygaszania, bezpośrednio korelując z współczynnikami matematycznymi w równaniu. Efekt pH wykazał wyraźne optimum około pH 6,7, odzwierciedlając złożoną relację między stanami protonacji zarówno grup funkcyjnych powierzchni B,N CQDs, jak i lisinoprilu. Przy niższych wartościach pH, nadmierna protonacja prowadzi do agregacji B,N CQDs z powodu zmniejszonego odpychania elektrostatycznego między cząstkami. Z drugiej strony, przy wyższych wartościach pH, deprotonacja grupy aminowej w lisinoprilu zapobiega jej skutecznemu oddziaływaniu z ujemnie naładowaną powierzchnią deprotonowanych B,N CQDs, prowadząc do odpychania elektrostatycznego, a nie przyciągania. Ta zależność od pH jest zgodna z ujemnym współczynnikiem kwadratowym (A² = -0,686) i wyjaśnia paraboliczną zależność obserwowaną eksperymentalnie. Efekt stężenia B,N CQDs wykazał wzrost wydajności wygaszania do około 72 μg mL^-1, po czym zaobserwowano plateau. To zachowanie odzwierciedla nasycenie dostępnych miejsc wiążących i jest zgodne z dodatnim współczynnikiem liniowym (0,414689) i ujemnym terminem kwadratowym (-0,589935). Efekt czasu reakcji wskazał na szybką równowagę w ciągu 3 min, sugerując wydajną kinetykę tworzenia kompleksu, która potwierdza mechanizm wygaszania statycznego ustalony w badaniach mechanistycznych.

Czy metoda jest wiarygodna i precyzyjna?

Kompleksowa walidacja metody została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi ICH Q2(R2) w celu ustalenia analitycznych charakterystyk wydajności opracowanej metody wygaszania fluorescencji. Metoda wykazała doskonałą liniowość w zakresie stężeń 0,02-2,0 μg mL^-1 ze współczynnikiem korelacji (r²) wynoszącym 0,9998, wskazując na silną liniową zależność między wygaszaniem fluorescencji a stężeniem lisinoprilu. Granice wykrywalności (LOD) i oznaczalności (LOQ) obliczono odpowiednio jako 6,21 ng mL^-1 i 18,63 ng mL^-1, przy użyciu podejścia odchylenia standardowego ślepej próby i nachylenia (LOD = 3,3σ/S, LOQ = 10σ/S). Te granice wykrywalności wykazują doskonałą czułość w porównaniu z wieloma istniejącymi metodami analitycznymi do oznaczania lisinoprilu i umożliwiają ilościowe oznaczenie w stężeniach istotnych terapeutycznie w matrycach biologicznych.

Ocena dokładności wykazała doskonały odzysk z ogólną dokładnością 98,14 ± 0,857% na podstawie dziewięciu oznaczeń na trzech poziomach stężeń, potwierdzając minimalny błąd systematyczny w procedurze analitycznej. Badania precyzji wykazały zadowalającą powtarzalność z precyzją powtarzalności (wewnątrzdobową) wynoszącą 0,873% RSD i precyzją pośrednią (międzydobową) wynoszącą 1,244% RSD, obie dobrze w granicach akceptowalnych dla analizy farmaceutycznej (<2% RSD). Ocena odporności oceniła odporność metody na małe zmiany krytycznych parametrów, dając odzyski 101,80 ± 1,397% dla zmian pH buforu, 98,90 ± 0,804% dla zmian stężenia odczynnika i 100,68 ± 0,889% dla modyfikacji czasu reakcji. Te wyniki potwierdzają, że niewielkie zmiany analityczne nie wpływają znacząco na wydajność metody, wspierając niezawodność metody dla rutynowych zastosowań analitycznych.

Badania selektywności wykazały wysoką wydajność metody dla oznaczania lisinoprilu w obecności potencjalnych interferentów powszechnie występujących w preparatach farmaceutycznych i matrycach biologicznych. Podczas gdy lisinopril wykazał niezwykłą wydajność wygaszania około 67%, wszystkie testowane interferenty, w tym sole nieorganiczne (Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺), metale przejściowe (Ni²⁺, Cd²⁺), aniony (SO₄^2-, PO₄^3-), substancje pomocnicze (skrobia, laktoza, celuloza, stearynian magnezu, laurylosiarczan sodu) i składniki biologiczne (tryptofan, tyrozyna, kwas glutaminowy, glukoza) wykazały zaniedbywalną interferencję z wydajnością wygaszania poniżej 5%. Co ważne, strukturalnie podobne inhibitory ACE, w tym kaptopryl, enalapryl i ramipryl, wykazały znacznie niższą wydajność wygaszania (poniżej 5%) w porównaniu z lisinoprilem, pomimo ich podobieństw strukturalnych, potwierdzając doskonałą selektywność metody nawet wobec blisko spokrewnionych związków. Ta wysoka selektywność może być przypisana specyficznemu mechanizmowi interakcji między B,N CQDs a unikalnymi cechami strukturalnymi lisinoprilu, szczególnie jego grupami funkcyjnymi aminowymi i kwasu karboksylowego, które umożliwiają optymalną geometrię wiązania, jak potwierdzają obliczenia mechaniki kwantowej.

Jak oceniamy zrównoważoność i praktyczność metody?

Kompleksowe badanie walidacyjne ustala, że opracowana metoda wygaszania fluorescencji B,N CQDs spełnia wszystkie wymagania ICH dla analizy farmaceutycznej z doskonałymi analitycznymi charakterystykami wydajności. Kombinacja doskonałej liniowości, wysokiej czułości, zadowalającej precyzji i dokładności, solidnej wydajności i wysokiej selektywności sprawia, że metoda ta jest wysoce odpowiednia do ilościowego oznaczania lisinoprilu w preparatach farmaceutycznych i próbkach biologicznych, oferując znaczące zalety w porównaniu z istniejącymi podejściami analitycznymi pod względem prostoty i efektywności kosztowej.

Praktyczna zastosowanie opracowanej metody wygaszania fluorescencji B,N CQDs została oceniona poprzez analizę rzeczywistych preparatów farmaceutycznych i próbek biologicznych, aby wykazać jej przydatność do rutynowych zastosowań analitycznych. Przeprowadzono statystyczne porównanie z referencyjną metodą HPLC w celu oceny równoważności metody i ustalenia wiarygodności analitycznej w rzeczywistych warunkach.

Metoda została z powodzeniem zastosowana do oznaczania lisinoprilu w komercyjnych tabletkach (Zestril®, 10 mg) z doskonałą wydajnością analityczną. Opracowana metoda fluorescencyjna dała średni odzysk 100,03 ± 0,724% (n = 5), wykazując wysoką dokładność i precyzję dla analizy farmaceutycznej. Statystyczne porównanie z referencyjną metodą HPLC wykazało średni odzysk 99,69 ± 0,99% dla tych samych próbek tabletek. Test t-Studenta (obliczony t = 0,523) był znacznie niższy od wartości tabelarycznej (t = 2,306 przy P = 0,05), wskazując na brak statystycznie istotnej różnicy między metodami. Podobnie, test F (obliczony F = 1,873) był poniżej wartości krytycznej (F = 6,338 przy P = 0,05), potwierdzając równoważną precyzję między metodami. Ocena odchylenia przy użyciu kryterium akceptacji ±2% wykazała θ_L = -0,920 i θ_U = 0,558, oba w akceptowalnych granicach, ustanawiając równoważność metody i potwierdzając brak systematycznego odchylenia. Te wyniki potwierdzają dokładność i wiarygodność opracowanej metody dla zastosowań w kontroli jakości farmaceutycznej.

Jakie perspektywy rozwoju i wyzwania stoją przed metodą?

Badania odzysku zostały również przeprowadzone przy użyciu wolnego od leku osocza ludzkiego z dodatkiem znanych stężeń lisinoprilu w celu oceny wydajności metody w matrycach biologicznych. Metoda wykazała doskonały odzysk w testowanym zakresie stężeń (0,05-1,5 μg mL^-1) z procentami odzysku wahającymi się od 97,46% do 103,64%. Przy najniższym stężeniu (0,05 μg mL^-1), metoda osiągnęła 97,46% odzysku z 3,454% RSD, wykazując zadowalającą wydajność blisko granicy oznaczalności. Stężenia średniego zakresu (0,1 i 0,5 μg mL^-1) wykazały optymalną wydajność z odzyskami odpowiednio 103,64% i 102,36% oraz poprawioną precyzją (RSD < 3%). Przy najwyższym stężeniu (1,5 μg mL^-1), metoda utrzymała doskonałą dokładność (97,81% odzysku) z najlepszą precyzją (1,353% RSD). Spójne wartości odzysku w całym zakresie stężeń i akceptowalna precyzja (RSD < 5%) potwierdzają przydatność metody do zastosowań bioanalitycznych.

Kompleksowa ocena metod analitycznych wymaga oceny wykraczającej poza tradycyjne parametry wydajności analitycznej, aby uwzględnić wpływ na środowisko i praktyczną stosowalność. Aby zapewnić holistyczną ocenę zrównoważonego rozwoju i praktyczności opracowanej metody fluorescencji B,N CQDs do oznaczania lisinoprilu, zastosowano cztery uzupełniające narzędzia oceny: Analytical GREEnness Metric (AGREE), Modified Green Analytical Procedure Index (MoGAPI), Blue Applicability Grade Index (BAGI) i Click Analytical Chemistry Index (CACI). To podejście wielowskaźnikowe zapewnia kompleksową ocenę z perspektywy środowiskowej, praktycznej i implementacyjnej.

Wskaźnik AGREE, oparty na 12 zasadach zielonej chemii analitycznej (SIGNIFICANCE), przekształca kryteria oceny w ujednoliconą skalę 0-1 z wynikami prezentowanymi jako piktogram w kształcie zegara. Dla metody fluorescencji B,N CQDs, ocena wykazała doskonałą wydajność środowiskową z wynikiem 0,77. Metoda wykazała szczególnie silną wydajność w (1) minimalnym przygotowaniu próbki wymagającym tylko prostych procedur ekstrakcji dla preparatów farmaceutycznych i wytrącania białka dla próbek biologicznych bez etapów derywatyzacji, (2) minimalnym zużyciu odczynników, w tym 1,0 mL buforu Brittona-Robinsona i 0,7 mL roztworu B,N CQDs, reprezentujących znacznie zmniejszone zużycie chemikaliów w porównaniu z konwencjonalnymi metodami chromatograficznymi, (3) doskonałej efektywności energetycznej ze spektroskopią fluorescencyjną zużywającą mniej niż 0,15 kWh na próbkę poprzez działanie w temperaturze pokojowej oraz (5) zmniejszoną generacją odpadów produkującą minimalne odpady wodne (<5 mL na próbkę) bez konieczności stosowania rozpuszczalników organicznych do etapu oznaczania.

Ocena MoGAPI, która łączy wizualny wpływ GAPI z ilościową punktacją całkowitą, dała wynik 80%, klasyfikując metodę jako doskonale zieloną. Wysoki wynik odzwierciedlał (1) off-line pobieranie próbek bez wymagań dotyczących konserwacji i minimalnych rozważań transportowych, (2) proste procedury analityczne bez złożonych wymagań ekstrakcyjnych działających w temperaturze pokojowej, (3) łatwo dostępne odczynniki z B,N CQDs syntezowanymi z dostępnych komercyjnie prekursorów, w tym kwasu cytrynowego, kwasu borowego i mocznika, przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego, (4) dostępną aparaturę wykorzystującą standardowy sprzęt do spektroskopii fluorescencyjnej dostępny w większości laboratoriów analitycznych oraz (5) minimalny wpływ na środowisko poprzez zmniejszoną generację odpadów i niskie zużycie energii. Ocena MoGAPI potwierdziła doskonałą wydajność środowiskową metody w porównaniu z konwencjonalnymi podejściami analitycznymi do oznaczania lisinoprilu, szczególnie podkreślając zalety użycia zielonych rozpuszczalników i uproszczonych procedur analitycznych.

Wskaźnik BAGI ocenia praktyczność metod analitycznych, koncentrując się na praktycznych aspektach poprzez ocenę dziesięciu głównych atrybutów. Opracowana metoda osiągnęła wynik 77,5, wskazując na dobrą wydajność praktyczną z kilkoma mocnymi stronami. Ocena wykazała (1) możliwość ilościowego oznaczania z potencjałem potwierdzającym poprzez spektroskopię fluorescencyjną dostarczającą solidnych informacji analitycznych, (2) szybką przepustowość próbek z 3-minutowym czasem analizy umożliwiającym przetwarzanie ponad 20 próbek na godzinę, spełniając wymagania laboratorium o wysokiej przepustowości, (3) doskonałą dostępność odczynników ze wszystkimi wymaganymi chemikaliami dostępnymi komercyjnie i prostą syntezą B,N CQDs przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego oraz (4) minimalne wymagania dotyczące przygotowania próbki obejmujące tylko proste rozcieńczenie lub wytrącanie białka, osiągając wysokie wyniki praktyczności. Obszary zidentyfikowane do potencjalnej poprawy obejmowały (1) rozszerzenie z oznaczania pojedynczego analitu do możliwości wielu analitów oraz (2) zwiększoną implementację automatyzacji dla w pełni bezobsługowej operacji.

Ocena CACI, podkreślająca prostotę, wydajność i niezawodność inspirowane zasadami chemii kliknięć, dała wynik 70, wskazując na wysoce praktyczną wydajność metody. Ocena wykazała doskonałe dostosowanie do zasad analitycznej chemii kliknięć poprzez (1) uproszczone przygotowanie próbki, (2) doskonałą wykonalność ze wszystkimi odczynnikami dostępnymi komercyjnie, standardową aparaturą fluorescencyjną dostępną w większości laboratoriów i szacowanym kosztem mniejszym niż 10 USD na analizę próbki, (3) możliwość ilościowego oznaczania stosowaną do preparatów farmaceutycznych i matryc biologicznych, wykazującą wszechstronność analityczną, (4) akceptowalną czułość z granicą wykrywalności 6,21 ng mL^-1 reprezentującą mniej niż 1% stężeń farmaceutycznych oraz (6) szybki czas analizy. Ocena CACI potwierdziła praktyczne zalety metody, w tym prostotę, efektywność kosztową i szybką implementację odpowiednią dla rutynowych zastosowań analitycznych.

Kompleksowa ocena wielowskaźnikowa wykazuje, że opracowana metoda fluorescencji B,N CQDs wykazuje doskonałe cechy środowiskowe z wysoką praktyczną stosowalnością. Wszystkie cztery wskaźniki konsekwentnie zidentyfikowały mocne strony metody w zakresie zrównoważenia środowiskowego poprzez minimalne zużycie odczynników, brak rozpuszczalników organicznych, niskie wymagania energetyczne i zmniejszoną generację odpadów, w połączeniu z praktycznymi zaletami implementacji, w tym prostymi procedurami, łatwo dostępnymi odczynnikami i aparaturą oraz szybkimi czasami analizy. Wyniki oceny AGREE (0,77), MoGAPI (80%), BAGI (77,5) i CACI (70) wspólnie ustanawiają metodę jako zrównoważoną i praktyczną alternatywę dla rutynowego oznaczania lisinoprilu, wykazując znaczące ulepszenia w porównaniu z konwencjonalnymi podejściami analitycznymi i wspierając przejście w kierunku bardziej odpowiedzialnych środowiskowo praktyk analitycznych w kontroli jakości farmaceutycznej i zastosowaniach bioanalitycznych.

W podsumowaniu, niniejsze badanie z powodzeniem opracowało i zwalidowało nowatorską metodę wygaszania fluorescencji do oznaczania lisinoprilu przy użyciu kropkowych nanocząstek węglowych domieszkowanych B,N jako sond fluorescencyjnych. Syntezowane B,N CQDs wykazały jednorodną morfologię ze średnią średnicą 3,97 nm i doskonałe właściwości optyczne, w tym intensywną niebieską fluorescencję z maksimum wzbudzenia przy 360 nm i emisją przy 429 nm. Kompleksowe badania mechanistyczne poprzez analizę Sterna-Volmera, badania termodynamiczne i obliczenia mechaniki kwantowej potwierdziły wygaszanie statyczne poprzez tworzenie kompleksu w stanie podstawowym, ze stałymi Sterna-Volmera malejącymi z 7,94 × 10⁵ do 5,48 × 10⁵ M^-1 wraz ze wzrostem temperatury z 298 do 313 K. Badania mechaniki kwantowej wykazały energię wiązania -33,58 kJ mol^-1, wykazując doskonałą zgodność z eksperymentalnymi parametrami termodynamicznymi (ΔG = -35,01 kJ mol^-1). Systematyczna optymalizacja przy użyciu metodologii powierzchni odpowiedzi Box-Behnken zidentyfikowała optymalne warunki pH 6,7, stężenie B,N CQDs 70 μg mL^-1 i 3-minutowy czas reakcji. Opracowana metoda wykazała doskonałą wydajność analityczną z zakresem liniowym 0,02-2,0 μg mL^-1, granicą wykrywalności 6,21 ng mL^-1 i granicą oznaczalności 18,63 ng mL^-1. Walidacja metody zgodnie z wytycznymi ICH Q2(R2) potwierdziła zadowalającą dokładność (98,14 ± 0,857%), precyzję (RSD < 1,25%) i odporność. Pomyślne zastosowanie do komercyjnych preparatów tabletek dało odzysk 100,03 ± 0,724%, podczas gdy próbki osocza ludzkiego z dodatkiem wykazały doskonały odzysk w zakresie od 97,46% do 103,64%. Metoda oferuje znaczące zalety w porównaniu z konwencjonalnymi podejściami analitycznymi, w tym efektywność kosztową poprzez proste wymagania dotyczące odczynników, działanie w temperaturze pokojowej eliminujące potrzeby kontroli termicznej, szybki czas analizy umożliwiający wysoką przepustowość próbek oraz doskonały profil środowiskowy z kompleksowymi ocenami zrównoważonego rozwoju (AGREE: 0,77, MoGAPI: 80%, BAGI: 77,5, CACI: 70).

Pomimo obiecującej wydajności analitycznej i praktycznych zalet, kilka ograniczeń wymaga rozważenia dla przyszłego rozwoju. Główne ograniczenie dotyczy wyzwań związanych z selektywnością podczas analizy złożonych matryc biologicznych zawierających strukturalnie podobne związki z grupami funkcyjnymi aminowymi i kwasu karboksylowego. Chociaż metoda wykazała doskonałą selektywność wobec testowanych interferentów, mechanizm wygaszania fluorescencji opiera się na specyficznych interakcjach między B,N CQDs a grupami funkcyjnymi lisinoprilu, które mogą nie zapewniać absolutnej selektywności w obecności strukturalnie pokrewnych leków. Przyszłe badania powinny koncentrować się na zwiększeniu selektywności metody poprzez zaawansowane strategie rozpoznawania, szczególnie rozwój polimerów z odciskiem molekularnym (MIP) w połączeniu z B,N CQDs. Materiały kompozytowe MIP-CQDs mogłyby zapewnić podwójne mechanizmy rozpoznawania, łącząc właściwości fluorescencyjne B,N CQDs z selektywnymi wnękami wiążącymi polimerów z odciskiem molekularnym, tym samym znacznie poprawiając selektywność wobec strukturalnie podobnych interferentów. Dodatkowo, modyfikacja powierzchni B,N CQDs za pomocą specyficznych elementów rozpoznawania lub aptamerów mogłaby zwiększyć selektywność przy jednoczesnym zachowaniu doskonałej wydajności analitycznej. Integracja z zaawansowanymi technikami separacji, takimi jak elektroforeza kapilarna lub urządzenia mikrofluidyczne, mogłaby zapewnić dodatkowe wymiary selektywności, podczas gdy rozszerzenie metody na jednoczesne oznaczanie wielu inhibitorów ACE poprzez podejścia kalibracji wielowymiarowej zwiększyłoby praktyczną stosowalność. Ta praca stanowi znaczący postęp w analizie farmaceutycznej, oferując zrównoważoną, ekonomiczną i czułą alternatywę dla oznaczania lisinoprilu z obiecującym potencjałem do dalszego rozwoju w zastosowaniach bioanalitycznych.

Podsumowanie

Badania przedstawiają opracowanie nowatorskiej metody oznaczania lisinoprilu z wykorzystaniem kropkowych nanocząstek węglowych domieszkowanych borem i azotem (B,N CQDs). Syntezowane nanocząstki o średniej średnicy 3,97 nm wykazują intensywną niebieską fluorescencję, która jest selektywnie wygaszana przez lisinopril. Mechanizm wygaszania opiera się na tworzeniu kompleksu w stanie podstawowym, co potwierdzono badaniami termodynamicznymi i obliczeniami kwantowymi. Metoda charakteryzuje się wysoką czułością z granicą wykrywalności 6,21 ng/mL, doskonałą precyzją (RSD < 1,25%) i dokładnością (98,14%). Została z powodzeniem zastosowana do analizy preparatów farmaceutycznych i próbek osocza, wykazując odzysk w zakresie 97-103%. Ocena środowiskowa potwierdziła jej zrównoważony charakter i praktyczność, co czyni ją atrakcyjną alternatywą dla konwencjonalnych technik analitycznych.